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His融合蛋白純化常見問題解答

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  蛋白過鎳柱純化的原理:Ni-NTA純化介質純化帶有His6-Tag的融合蛋白是目前蛋白純化中最常使用的一種方法。Ni柱中的氯化鎳或者硫酸鎳可以與有HIs(組蛋白)標簽的堿性蛋白蛋白結合,組蛋白標簽一般是6個組氨酸(堿性氨基酸)。在蛋白上樣后,帶有組氨酸標簽的蛋白特異性結合到柱子里,其他的雜蛋白流出。Ni柱中的氯化鎳或者硫酸鎳也可以與咪唑結合,采用咪唑洗脫,咪唑競爭性結合到硫酸鎳上,目的蛋白就被洗脫了,這時候收集穿出液,里面就是目的蛋白,然后透析掉咪唑即可。上樣,清洗,洗脫,基本三個步驟就結束了。

  

 

  1. His 標簽蛋白沒有與柱結合:

  

 

  a)可能原因:超聲的功率不對(太大,蛋白炭化,太小,蛋白沒有釋放)

  解決方法:改變超聲功率,并在超聲前加入溶菌酶

  b)可能原因:樣品或者是結合緩沖液不正確:

  解決方法:檢測pH 及樣品和結合緩沖液的組成份。確保在溶液中鰲合劑或強還原劑的濃度及咪唑的濃度不是太高。

  c)可能原因:組氨酸標簽暴露不完全

  解決方法:在變性條件下( 用4-8 M 脲,或4-6 M 鹽酸胍) 進行純化。

  d)可能原因:His標簽丟失

  解決方法1:WB 檢查His 是否表達,上游構建,改變His-tag 的位置(C-端或N-端),必要時增加His個數。

  解決方法2:孵育的時間不夠,降低流速和增加孵育的時間。

  解決方法3:改變螯合的金屬離子,尋找到最佳的結合金屬離子。

  Ni2+通常是從宿主細胞蛋白中純化大多數6×His標記的重組蛋白質的首選金屬離子。也是一般最常用的離子。蛋白和金屬離子之間的結合強度受幾種因素影響,包括長度、位置、親和標記在蛋白的暴露程度、所用離子的類型、以及緩沖液的pH,因此一些蛋白用其他離子可能更容易地進行純化而不用Ni2+。

  2. His 標簽蛋白沒有被洗脫下來:

  a)可能原因:洗脫條件太溫和(組氨酸標記的蛋白質仍然結合在柱上,結合力較強)

  解決方法:增加咪唑的梯度洗脫或降低pH 來找出最佳的洗脫條件。

  b)可能原因:降低pH 的方法洗脫的,若pH 低于3.5,會導致鎳離子脫落

  解決方法:改變洗脫辦法,咪唑競爭性洗脫

  c)可能原因:蛋白已沉淀在柱上

  解決方法:減少上樣量,或使用咪唑的線性梯度而不是分步洗脫以降低蛋白的濃度。試用去污劑或改變NaCl 的濃度,或在變性條件( 去折疊)下洗脫( 用4-8 M 脲,或4-6 M 鹽酸胍)。

  d)可能原因:非特異性疏水或其他相互反應

  解決方法:加非離子去污劑到洗脫緩沖液(如:2% Triton X-100)或增加NaCl的濃度。

  3. His 標簽蛋白洗脫后雜帶較多

  

 

  a)可能原因:蛋白酶部分降解了標簽蛋白

  解決方法:添加蛋白酶抑制劑。

  b)可能原因:雜質對鎳離子有更高的親和性

  解決方法1:咪唑濃度必須優化,以確保高純度( 宿主細胞蛋白質的低結合) 和高產率( 組氨酸標記的目標蛋白質的強結合) 之間的最佳平衡。分步或者線性洗脫摸索出最優的咪唑結合和清洗濃度;在樣品中加入與結合緩沖液同樣濃度的咪唑;咪唑的梯度不大(20 個或更多的柱床體積),可能分離出有相似結合強度的蛋白

  解決方法2:篩選最適合的緩沖液條件,NaCl 濃度,pH的范圍都需要進行篩選。對于單一目標蛋白在進行緩沖液篩選時,將緩沖液、鹽、甘油和還原劑設計成不同的混合配方來進行優化。

  解決方法3:若以上優化的條件都不能去除雜質蛋白,需要考慮多步純化的思路,如利用Strep 標簽進行兩步純化或采用Subtractive method 進行純化。

  c)可能原因:雜質和標簽蛋白結合在一起

  解決方法:在超聲破碎細胞之前加入去垢劑或者還原劑;增加去垢劑的濃度( 2% Triton X-100 or 2% Tween 20);或者在Wash buffer 中增加甘油的濃度(50%) 減少非特異性的相互反應;考慮增加咪唑的濃度或者改變金屬離子。

  d)可能原因:洗滌不充分

  解決方法:增加洗滌的次數,使洗滌充分。

  4. 使用幾次后Ni柱載量下降,掛柱效率低,如何處理?

  可能原因:逐漸積累沉淀,變性或非特異結合的蛋白占據了有效的結合位點,而通過洗脫液無法徹底清洗所致。

  較溫和的清洗方法:

  用2倍柱體積的6M鹽酸胍或8M尿素洗滌,然后用5倍體積的緩沖液洗滌,以去除沉淀或變性物質。用2倍柱體積的1% Triton X-100洗滌,然后用5倍柱體積的緩沖液洗滌,以去除疏水結合的物質。若改變不明顯,可選擇強烈清洗方式。

  強烈清洗方式:

  首先用5-10倍柱體積的脫鎳緩沖液(20 mM 磷酸鈉, 0.5 M NaCl, 50 mM EDTA, pH 7.4)洗滌,迚行脫鎳操作,然后用5-10倍柱體積的平衡緩沖液沖洗,最后用5-10倍柱體積的雙蒸水沖洗;隨后進行清洗操作,去除離子型雜蛋白,可以用5倍柱體積的1.5 M NaCl溶液,然后10倍柱體積的雙蒸水沖洗;去除沉淀或變性蛋白,可以用1M氫氧化鈉溶液,結合1-2小時,然后用10倍柱體積的平衡緩沖液和10倍柱體積的雙蒸水迚行沖洗;去除疏水蛋白或者脂蛋白,可以用5-10倍柱體積的30%異丙醇溶液清洗,然后10倍柱體積的雙蒸水洗滌;最后進行生鎳操作,用0.1M硫酸鎳上柱,隨后5倍柱體積的雙蒸水和平衡緩沖液迚行洗滌,如需保存,保存在20%乙醇溶液。

  5. 鎳柱使用中出現棕色是怎么回事?

  可能原因:緩沖液中DTT的影響, DTT會對鎳柱的顏色和純化效率有很大的影響,在堿性的緩沖液條件下,鎳離子會被DTT還原生成棕色的沉淀,所以要盡量避免DTT的參與。

  因此,若您的樣品中含有DTT,在上樣之前, 我們推薦采用不含還原性試劑的空白運行來除去任何較弱結合的鎳離子;空白運行方法(使用不含還原劑的平衡液和洗脫液)1)5倍柱體積的雙蒸水洗柱;2)5倍柱體積的平衡液洗柱;3)5倍柱體積的洗脫液洗柱;4)10倍柱體積的平衡液平衡。當不使用時,勿將Ni Sepharose 6 Fast Flow保存于含還原性試劑的緩沖液中。

  6. 填料是否可以重復使用?可以使用多少次?

  如果維護的好的話,填料在其效期之內可以一直重復使用。如果每次都是純化同樣的蛋白就沒有必要剝離掉鎳離子重新掛鎳,一般經過5-7次純化之后可以進行脫鎳和再生鎳的操作。如果柱子反壓高了,填料需要做徹底的在位清洗CIP,在清洗之前,為了避免金屬鹽的沉淀,需要剝離掉鎳離子,然后再重新掛鎳,清洗后保存在20%的乙醇中。

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